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差異表達(dá)與聚類分析
2018-06-09
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差異表達(dá)與聚類分析

在鑒定出ncRNA后，我們?nèi)绾瓮茢嗥淇赡艿纳飳W(xué)功能呢？首先對于miRNA等作用機(jī)制比較清楚的ncRNA，我們可以參考其作用機(jī)制，利用堿基互補(bǔ)等方式預(yù)測其靶標(biāo)，并進(jìn)而推斷其生物學(xué)功能。然而,對于longnon-coding RNA等具體作用機(jī)制尚待明確的非編碼RNA，這個(gè)方法就不適用了。這時(shí)，我們可以根據(jù)在表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，表達(dá)相關(guān)的基因往往具有功能相似性這一特征，利用表達(dá)相關(guān)來推斷其功能。具體來說，在實(shí)際研究中，我們主要關(guān)注兩類表達(dá)關(guān)聯(lián)，在不同條件下差異表達(dá)的基因，以及不同條件下共表達(dá)的基因。

在不需要考慮實(shí)驗(yàn)誤差的理想世界里，差異表達(dá)基因檢測是很容易的。我們只需要直接比較不同條件下檢測出的表達(dá)量數(shù)值即可。然而，在現(xiàn)實(shí)世界中，情況要復(fù)雜的多。事實(shí)上，在真實(shí)的實(shí)驗(yàn)過程中，由于隨機(jī)誤差（andomerror）的存在，我們得到的測量值永遠(yuǎn)是一個(gè)分布而非一個(gè)定值。因此，不同條件下基因表達(dá)水平的比較實(shí)質(zhì)上是對兩個(gè)分布的比較，換句話說，除了均值之外，我們還需要考慮方差的影響。我們需要利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，基于概率模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。具體來說，我們需要構(gòu)建一個(gè)考慮方差的統(tǒng)計(jì)量（tatistic），而后基于這個(gè)統(tǒng)計(jì)量的零分布（NULLdistribution）來計(jì)算每個(gè)基因的p-value,最后選擇小于給定cut-off p-value的基因作為有統(tǒng)計(jì)顯著性差異表達(dá)的基因。
針對RNA-Seq數(shù)據(jù)的特定，不同研究組基于Possion,負(fù)二項(xiàng)分布等構(gòu)造了不同的統(tǒng)計(jì)量和差異表達(dá)計(jì)算的方法。由于這些方法基于不同的假設(shè)，其零分布之間也存在顯著的差異，從而導(dǎo)致了最終的p-value乃至calling結(jié)果的差異。為了便于選擇合適的方法。OoronBetel等人基于多組數(shù)據(jù)集對常用的差異表達(dá)工具進(jìn)行了系統(tǒng)評估。p-value本質(zhì)上對統(tǒng)計(jì)錯(cuò)誤可能性的一個(gè)概率表示。具體來說，我們在實(shí)際中可能會碰到兩類錯(cuò)誤，一類錯(cuò)誤又稱假陽性錯(cuò)誤，指實(shí)際并沒有差異表達(dá)的基因錯(cuò)當(dāng)成了有差異表達(dá)的基因，二類錯(cuò)誤又稱假陰性錯(cuò)誤，值實(shí)際表達(dá)有差異的基因錯(cuò)當(dāng)成了沒有差異表達(dá)。

  一般來說，我們會用p-value表示一次檢驗(yàn)中發(fā)生一類錯(cuò)誤--也就是假陽性的錯(cuò)誤--的概率。在實(shí)踐中，我們通常對多個(gè)基因重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。這時(shí)就碰到多重檢驗(yàn)問題（multipletestinglssue）.例如，我們對20個(gè)不同的基因一次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，每次檢驗(yàn)的p-value都為0.05，那么也就是說，我們每次犯錯(cuò)誤的概率是0.05，我們不犯錯(cuò)誤的概率是0.95，根據(jù)乘法原理，連續(xù)20次不犯錯(cuò)誤的概率就是0.95的20次方，約0.358。我們至少犯一次錯(cuò)誤的概率是1-0.358=0.642.也就是說，即使每次出錯(cuò)的概率都是0.05，但20次最終任由超過一半的概率至少犯一次錯(cuò)誤。這就是所謂的multipletesting issue.為了解決這個(gè)問題，最簡單的辦法就是將p-value的cut-off改的更嚴(yán)。例如，Bonferronicorrection中，會將檢驗(yàn)得到的原始p-value乘以檢驗(yàn)進(jìn)行的次數(shù)。因此，假如，我們對人類基因組3萬個(gè)基因只在原始p-value小于0.05/30000=1.67*10^-6時(shí)才將之作為差異表達(dá)基因。就可以確保及時(shí)在最糟糕的情況下，也可以確保假陽性錯(cuò)誤發(fā)生的概率小于0.05.然而，在實(shí)踐中Bonferronicorrection往往過于嚴(yán)格了。為了確保降低假陽性而抬高了假陰性錯(cuò)誤發(fā)生的概率，從而降低了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的效力（power）.同時(shí)，相對于全體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的基因，我們在實(shí)際研究中往往更關(guān)心在已經(jīng)被標(biāo)記為差異表達(dá)的記憶中，有多少假陽性的基因。換句話說，我們關(guān)心的是FDR而不是FWER.這時(shí)，可以將p-value轉(zhuǎn)變?yōu)閝-value.類似于p-value，q-value也是對統(tǒng)計(jì)錯(cuò)誤可能性的表示（measure）.然而，于p-value不同的是，q-value衡量的是FalseDISCOVERYRate,對于給定的基因G，q-value給出的是在和基因g一樣或更顯著的差異基因群體中，假陽性發(fā)生的比率。
對于差異表達(dá)類似，在不同條件下共表達(dá)的關(guān)系也可以用來推斷基因的功能。對不同條件下多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行聚類分析（clustering）可以幫助快速的選擇共表達(dá)基因。正確的聚類分析，不但有助于推斷基因的功能，還可以有效的發(fā)現(xiàn)基因之間存在的調(diào)控關(guān)系。距離度量是聚類方法的核心。這里的距離度量，是指用來衡量兩個(gè)基因的表達(dá)模式之間的相似程度。常用的距離衡量有歐式距離，又稱絕對距離；和Peason距離，又稱關(guān)聯(lián)距離。其中歐式距離關(guān)心的是表達(dá)量，也就是兩個(gè)基因在表達(dá)水平之間的相似程度。而相關(guān)性距離則是關(guān)心的是表達(dá)模式，也就是兩個(gè)基因在表達(dá)變化上的一致性。不同的距離度量，可以得到迥然不同的結(jié)果。
由于共表達(dá)通常是指表達(dá)的變化趨勢，因此在實(shí)際分析中關(guān)聯(lián)距離使用的頻率更高一些。在應(yīng)用Pearson距離時(shí)，也要注意utlier對它的影響。由于Pearson距離以來于群體水平的協(xié)方差，如果有一些特殊的outlier,會對最終的結(jié)果產(chǎn)生極大的影響。


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